header
Klonowanie

Tu znajdziesz informacje o klonowaniu ...

 

KLONOWANIE I JEGO ZNACZENIE W  HODOWLI   ZWIERZĄT

 

klonowanie

KLONOWANIE

KLONOWANIE(kloning) są to metody uzyskiwania zwielokrotnionej liczby genetycznie identycznych komórek, zarodków lub organiamów roślinnych oraz zwierzęcych, a także otrzymywane kopii identycznych genów i  konstruktów genowych. Klonowanie drobnoustrojów (bakterii), najlepiej opanowane, jest równoznaczne z klonowaniem komórek; polega na namnażaniu, przez podziały mitotyczne, wyselekcjonowanych komórek bakteryjnych w odpowiednich pożywkach. Klonowanie zwierząt jest o wiele trudniejsze niż klonowanie roślin i ciągle mało efektywne;wykorzystuje się głównie metodę klonowania zarodków, udało się także klonowanie larw, płazów i organizmów dojrzałych.

 

KLONOWANIE DNA jest to powielanie wyizolowanych odcinków DNA za pośrednictwem różnych wektorów (plazmidów, wirusów lub ich pochodnych otrzymanych labolatoryjnie, np.kosmidów,a także sztucznych chromosomów), mających zdolność do samodzielnej replikacji w komórce bakteryjnej lub eukariotycznej. Zasada klonowania DNA w komórce bakteryjnej z użyciem plazmidów jako wektorów; przebiega ono w kilku etapach:

1)    odpowiednio dobrany enzym restrykcyjny tnie na fragmenty DNA przeznaczone do klonowania oraz przecina DNA plazmidów;

2)    enzym ligaza łączy ze sobą pocięte fragmenty, przy czym powstają cząsteczki zrekombinowanego DNA, w których fragment klonowanego DNA jest włączony do plazmidów;

3)    zrekombinowany plazmit zostaje wprowadzony do bakterii na drodze transformacji;

4)    w toku kolejnych podziałów bakteria wytwarza klon komórek, z których każda zawiera zrekombinowane plazmidy z klonowanym DNA; ten właśnie etap jest właściwym klonowaniem DNA.

W opisany sposób można stwrzyć bank DNA dowolnego organizmu, czyli rozklonować cały jego genom w komórkach bakteryjnych, przy czym w plazmidach poszczególnych klonów bakterii będą się mieścić różne fragmenty tego genomu; z biblioteki takiej można namnożyć dowolne ilości określonych fragmentów DNA do różnych badań. Klonować można zarówno losowo pocięte fragmenty DNA, jak i ściśle określone odcinki, m.in.geny (klonowanie genów). Obecnie DNA można powielać także bez klonowania go w komórkach, lecz stosując technikę łańcuchowej reakcji polimerazy.

klonowanie

[klonowanie DNA]Plazmid oraz odcinek obecnego DNA, przecięte tym samym enzymem restrykcyjnym pozostawiającym lepkie końce (kolor czerwony), łączy się, tworząc zrekombinowany plazmid, który wprowadza się do komórki bakteryjnej; po kolejnych podziałach powstaje klon bakterii ze zrekombinowanymi plazmidami zawierającymi obcy DNA.

 

KLONOWANIE DOROSŁYCH ORGANIZMÓW ZWIERZĘCYCH jest to metoda pozwalająca na uzyskanie kopii dojrzałego organizmu zwierzęcego, identycznej pod względem genetycznym. Klonowanie dorosłych organizmów zwierzęcych polega na pobraniu jądra komórkowego z komórki dojrzałego organizmy, i tj.z komórki wyspecjalizowanej, pełniącej konkretną funkcję, i przeniesieniu go do komórki jajowej lub do zygoty, uprzednio pozbawionych własnego jądra;zrekombinowana komórka jajowa bądź zygota rozwija się w zarodek, a następnie w organizm dojrzały. Zabieg jest trudny, w większości przypadków zarodki wcześniej umierają. W latach 70 XX wieku udało się sklonować dojrzały organizm żaby,pierwszym zaś ssakiem, który przyszedł na świat jako genetyczna kopia dorosłego osobnika była owca Dolly (w Institute of Animal Physiology and Genetic Research w Roslin k.Edynburga w 1997 roku). Z komórki sutka dojrzałej owcy pobrano jądro komórkowe, które następnie zostało wprowadzone do pobranej od  innej owcy komórki jajowej, której zostało usunięte jądro. Zrekombinowaną komórkę jajową utrzymano krótko w sztucznej hodowli, a wykształcony z niej zarodek wielokomórkowy przeniesiono do matki zastępczej, która urodziła prawidłowo rozwiniętą owce Dolly. W drugiej połowie 1997 roku na uniwersytecie w Honolulu R.Yanagimachi sklonował myszy. Uzyskane organizmy ponownie sklonował w 1998 roku, czym udowodnił,że w rzypadku ssaków możliwe jest uzyskanie linii klonów. Wyniki klonowania potwierdzają,że w każdym organizmie wielokomórkowym jądra komórkowe (materiał dziedziczny) są równowartościowe (totipotencjalne).

 

klonowanie

[klonowanie dorosłych organizmów zwierzęcych] Klonowanie owcy. A- pobranie komórki z nabłonka sutka owcy; B- pobranie komórki jajowej od następnej owcy i usónięcie z niej jądra komórkowego; C-wprowadzenie do bezjądrowej komórki jajowej jądra pochodzącego z komórki nabłonka sutka; D- wprowadzenie zarodka, rozwiniętego ze zrekombinowanej komórki jajowej, do układu rozrodczego owcy przygotowanej do ciąży; E- Dolly, klon owcy A.

 

KLONOWANIE GENÓW jest to powielanie wyizolowanych genów za pośrednictwem różnych wektorów mających zdolność do samodzielnej replikacji DNA. Samo klonowanie genów odbywa się podobnie jak klonowanie różnych innych odcinków DNA (klonowanie DNA), jednak w tym przypadku konieczne jest wyizolowanie sekwencji danego genu, co można osiągnąć różnymi metodami. Najprostrzy sposób wymaga izolacji kodowanych przez dany gen cząsteczek mRNA; są one sondą molekularną, za pomocą której identyfikuje się komplementarną do niej sekwencję we fragmentach DNA metodą- hybrydyzacji kwasów nukleinowych; sekwencja ta odpowiada poszukiwanemu genowi. Jeżeli nie dysponujemy cząsteczkami mRNA, natomiast znamy skład aminokwasowy białka kodowanego przez dany gen, można na podstawie znajomości – kodu genetycznego wydedukować przypuszczalną sekwencję DNA (lub mRNA) kodującą fragment tego białka, zsyntetyzować ją chemicznie i następnie użyć jako sondę molekularną do identyfikacji genu. Istnieją także inne metody uzyskiwania genów do klonowania. Nie zależnie jednak od sposobu otrzymania genu, dalsze postępowanie polega na złączeniu go z wektorem i wprowadzeniu do komórki, gdzie będzie się replikował. Banki sklonowanych genów służą jako źródło genów do badań naukowych i różnych manipulacji genetycznych, m.in. do otrzymywania transgenicznych organizmów(H.K.).

 

KLONOWANIE KOMÓREK jest to uzyskiwanie hodowli komórek z jednej komórki; rezultatem jest homogeniczna populacja komórek, tzw.klon.

 

 

KLONOWANIW LARW PŁAZÓW jest to metoda pozwalająca na uzyskanie kopii larwy płazów (kijanki) identycznej pod względem genetycznym. Polega ona na pobraniu jądra komórkowego z komórki organizmu larwy, tj. z komórki wyspecjalizowaej, pełniącej konkretną funkcję, i przeniesieniu go do komórki jajowej uprzednio pozbawionej własnego jądra; zrekombinowana komórka jajowa rozwija się następnie w zarodek, a ten w larwę. Zabieg jest trudny, w większości przypadków zarodki umierają, nie mniej w latach 70 XX otrzymano kilkanaście larw będących genetycznymi kopiami kijanki Xenopus laevis, z których kilka rozinęło się w dojrzałe osobniki. Eksperyment dostarczył dowodów na równowartościowość genomów zawartych we 3wszystkich komórkach organizmu.

 

 

KLONOWANIE TRANSGENICZNYCH SSAKÓW jest to postępowanie zmierzające do wyprodukowania klonu osobników mających jednakowe , celowo zmienione przez człowieka , genomy. Pierwsze sklonowane ssaki (owce) transgeniczne uzyskał w 1997r. zespół kierowany przez A.E.Schnieke, pracujący w Instytue of Animal Physiology and Genetic Research w Roslin k.Edynburga (Szkocja), tj. w tym samym instytuci, w którym wcześniej sklonowano pierwszego nietransgenicznego ssaka. W celu sklonowania transgenicznego ssaka naukowcy z Roslin:

a) pobrali komórki z płodu owcy i hodowli je pozaustrojowo przez szereg pasaży

b) do  hodowanych komórek wprowadzili ludzki gen sterujący produkcją czynnika   IX (czynnika krzepliwości krwi, którego niedobór powoduje hemofilię typu B);

c) z hodowli wyselekcjonowali te komórki, u których stwierdzono integrację wprowadzonego genu z ich materiałem dzidzicznym (komórki transformowane);

d) od owiec dawczyń (matek dawczyń) pobrali komórki jajowe i usunęli z nich jądra komórkowe

e) wyodrębnili jądra komórkowe z transformowanych komórek płodowych i wprowadzili je do bezjądrowych komórek jajowych

f) tak zmodyfikowane komórki jajowe wprowadzili do jajowodów owiec- matek zastępczych.

 

W wyniku przeniesienia transformowanych komórek jajowych urodziło się sześć jagniąt. U trzech z nich stwierdzono obecność ludzkiego genu odpowiedzialnego za produkcję czynnika IX. Jedno z jagniąt wkrótce padło. Pozostałe dwa nazwano Molly i Polly. Kiedy owce dorosną ich mleko zostanie poddane analizom biochemicznym i wtedy będzie można stwierdzić, czy w jego składzie znajduje się pożądane ludzkie białko. Obecnie czynnik IX otrzymuje się z ludzkiego osocza krwi. Dla jednego chorego potrzeba w ciągu roku co najmniej 500l osocza (od ok. 1000 dawców). Drugim sposobem jest produkcja tego czynnika przez transgeniczne bakterie. Jest to jednak metoda dwukrotnie droższa. Klony transgenicznych samic ssaków, zwłaszcza o dużej wydajności mlecznej (szczególnie krów), produkujące mleko zawierające pożądane białko, pozwolą na otrzymywanie czynnika IX w dużych ilościach, gdyż z mleka można go stosunkowo łatwo wyizolować. W przyszłości zostaną podjęte zapewne próby klonowania dorosłych osobników transgenicznych, które już sprawdziły się pod względem cech użytkowych.

 

 

KLONOWANIE ZARODKÓW jest to metoda pozwalająca na uzyskiwanie zwielokrotnionej liczby genetycznie identycznych zarodków. Klonowanie zarodków bezkręgowców i kręgowców przeprowadza się przez rozdzielenie blastomerów zarodków 2-,4- i 8- komórkowych; u ssaków stosuje się ponadto- dzielenie zarodków lub- transplantacje jąder komórkowych zarodków. Rozdzielanie blastomerów rozpoczyna się u ssaków od usunięcia z zarodka osłony przejrzystej. Dalsze postępowanie zależy od stadium, w jakim znajduje się zarodek. Rozdzielanie blastomerów zarodków 2- komórkowych dokonuje się za pomocą mikropipety, w specyficznym środowisku płynnym (pożywce), natomiast rozdzielanie blastomerów zarodków 4- i 8- komórkowych wymaga ich uprzedniej inkubacji w pożywkach pozbawionych jonów wapnia i magnezu, w temp. 37°C. Przez 15-20 min, po czym blastomery można stosunkowo łatwo rozdzielić, posługując się mikropipetą (osłabieniu ulegaja wiązania międzykomórkowe). Hodowlę in vitro izolowanych blastomerow prowadzi się do momentu osągnięcia przez nie stadium- moruli lub- blastocysty , kiedy to zarodki mogą być przeniesione bez osłonek do macic matek biorczyń. Mozliwości rozwojowe izolowanych blastomerow są różne u różnych gatunków ssaków. Pełny potencjał rozwojowy (rozwój aż do urodzenia) wykazały blastomery zarodków 2- komórkowych myszy, szczura, królika, kozy, owcy, świni, bydło, konia i pawiana oraz blastomery zarodków 8- komórkowych myszy, kozy, owcy i bydła. Klonowanie zarodków przez dzielenie polega na chirurgicznym przecięciu zarodka stadium moruli lub blastocysty na dwie komplementarne połowy. Metoda pozwala na uzyskanie dwóch identycznych zarodków (bliżnięta monozygotyczne); w przypadku ssaków zastosowano ją z powodzeniem u myszy, królika, owcy, świni i konia. Metoda transplantacji jąder polega na- przeniesieniu jąder komórkowych, uzyskane z jednego zarodka będącego w stadium moruli lub blastuli, do oocytow, zygot lub blastomerów tago samego gatunku, w których uprzednio usunięto jądra; metoda  ta pozwala na uzyskanie od jednego do kilkudzesięciu klonów genetycznie identycznych z zarodkiem, dawcą jąder.

Posługując się tą metodą, już w latach 50. uzyskano klony żab, a w 1997 roku po raz pierwszy sklonowano zarodek ssaka i 16 lutego 1998 roku w labolatorium PPL Therapeutics Inc. w USA urodził się byczek rasy Holstein, nazwany Jeffersonem. Klonowanie zarodków stosuje się dla celów badawczych, a także dla uzyskania liczniejszego potomstwa zwierząt mających szczególną wartość użytkową oraz do rozmnażania osobników gatunków ginących. Możliwość klonowania zarodków potwierdza, że jądra komórek wczesnego zarodka, powstających w wyniku podziałów mitotycznych, są pod względem możliwości rozwojowych równowartościowe [totipotencjalność].

 

klonowanie

[klonowanie zarodków] klonowanie metodą transplantacji nerek i jąder zarodkowych. Jądra wyizolowane z komórek zarodka żaby wprowadzono mikropipetką do komórek jajowych, z których usunięto własne jądro. Po aktywacji jaj nastąpił normalny rozwój. Powstałe klony żab były identyczne pod względem genetycznym, gdyż ich geny jądrowe pochodziły z jednego wyjściowego organizmu.

OWIECZKA     DOLLY

Jak stworzono Dolly?


klonowanie

  1. Komórki pobrane z wymienia owcy rasy Finn        Dorset umieszczono w specjalnej odżywce. Sprawia ona, że przestają się dzilić i przechodzą w   stan „uśpienia”.
  2. Od owcy rasy Scottish Blackface pobrano niezarłodnioną komórkę jajową. Następnie pozbawiono ją jądra zawierającego DNA.
  3. Za pomocą impulsów elektrycznych dokonano fuzji komórki wymienia i pozbawionej jądra komórki jajowej. W ten sposób powstał sklonowany zarodek.
  4. Po ok. 6 dniach zarodek został wszczepiony do macicy kolejnej owcy Scottish Blackface.
  5. Ta zastępcza matka urodziła jagnię rasy Finn Dorset- owieczkę Dolly.

POCZET KLONÓW


klonowanie

klonowanie

klonowanie

klonowanie

 

KLONOWANIE DOROSŁYCH OSOBNIKÓW-SPOSÓB NA ROZMNAŻANIE ZWIERZĄT TRANSGENICZNYCH

Trudno byłoby, niestety,wykorzystać klonowanie do ratowania zagrożonych gatunków, ponieważ nie można utworzyć z klonów populacji-z racji niebezpieczeństwa wystąpienia jednolitości, czyli niebezpieczeństwa śmierci całego gatunku. Moglibyśmy uratować jedynie dwa lub trzy osobniki.Bardziej realną sprawą jest klonowanie zwierząt, które są obdarzone jakąś charakterystyczną, cenną cechą, czyli w pierwszej kolejności zwierząt transgenicznych. Wyprodukowanie zwierzęcia transgenicznego, a więc zwierzęcia, które produkuje specyficzne substancje (np. laktoferynę- mleko jakościowo zbliżone do ludzkiego) czy farmaceutyki potrzebne do produkcji specyficznych lekarstw (np. insuliny),jest bardzo kosztowne i trudne, a przez rozmnażanie płciowe potomstwo może stracić sztucznie doczepioną cechę lub będzie ją miało niedostatecznie rozwiniętą. Obcy gen zwierząt transgenicznych nie zawsze jest przekazywany ich potomstwu. Np. samice transgenicznych myszy, posiadające wbudowany gen hormonu wzrostu szczura, były niepłodne, tylko samce z gatunku tych  mysz  przkazywały obcy gen. Klonowanie  obniżyłoby koszty, gwarantując powstanie identycznego osobnika. Właśnie na tym polu nowo odkryte klonowanie dorosłych osobników daje wielkie nadzieje. Zespół, który sklonował Dolly, pracuje na co dzień właśnie z transgenicznymi owcami. Wilmutowi i jego współpracownikom myśl o klonowaniu zwierząt transgenicznych towarzyszyła na drodze poszukiwań metody powielania dorosłych osobników. Podsumowując: jeśli klonujemy zarodek, wiemy wówczas tylko tyle, że ma on wartościowych rodziców i jedynie na tej podstawie można przypuszczać,że będzie on dla nas wartościowy. To tak, jakby powiedzieć, że jeśli ktoś pochodzi z dobrej rodziny, wówczas na pewno będzie posiadał wszystkie jej najlepsze cechy. Natomiast klonowanie dorosłego jest kopiowaniem już znanego materiału.

 

KIEDY KLONOWANIE JEST UŻYTECZNE?

 

Gdybyśmy chcieli stworzyć sztuczne populacje skonowanych osobników, tzn. jednego osobnika sklonować w twkiej ilości, by tworzył cała populację- taki proces nie daje perspektyw na długie przetrwanie gatunku w senie ewolucyjnym. Niczym nie różniłoby się to  od hodowli w pokrewieństwie, której hodowcy unikają (z powodów takich samych jak w przypadku człowieka). Dlatego praktyczne zainteresowanie hodowców klonowaniem jest stosunkowo niewielkie. Może zaistnieć wyłącznie potrzeba klonowania jakiegoś wybitnego zwierzęcia, konia wyścigowego lub transgenicznej krowy- tylko powielanie jednostkowych osobników jest cenne. Jednym z przykładów dotyczących efektywnej wielkości populacji może być stado, złożone z 200 krów i 200 buhajów czyli liczące 400 osobników. To efektywna wielkość całej populacji. Natomiast jeżeli mamy 1 buhaja i 399 krów to też daje liczbę 400. Jednak z punktu widzenia przekazywania genów na następne pokolenie, sytuacja jest identyczna z taką, w której krzyżowalibyśmy 2 buhaje z 2 krowami: tylko 4 osobniki. Ten pojedynczy buhaj staje się „wąskim gardłem” i to jego geny się rozpowszechniają.

 

DO CZEGO MOŻE SŁUŻYĆ KLONOWANIE ZWIERZĄT?

 

1)Do rozwiązywania takich problemów naukowych jak:

-wpływ starzenia się organizmu na funkcjonowanie genomu;

-czynniki wpływające na włączanie i wyłączanie genów w czasie rozwoju.

2)Przewidywane znaczenie praktyczne,np.:

-produkcja klonów owiec (lub innych zwierząt), które zostały wyselekcjonowane                 pod względem ważnych gospodarczo cech;

-produkcja klonów owiec transgenicznych, do których wprowadzono np. geny ludzkie odpowiedzialne za produkcję białek ważnych dla medycyny,np.insuliny, czynników krzepliwości krwi itp.;

-stworzenie modeli zwierzęcych naśladujących choroby człowieka.

Pierwszy punkt informuje nas o tym, że można pobierać komórki od rozmaitych osobników w różnym wieku i obserwować, jakie mają właściwości. Czy stwarza to możliwość, że nauka będzie mogła „podjąć walkę” ze starością?

Drugi punkt był już wielokrotnie rozważany, stał on poniekąd u podstaw odkrycia metody (zwierzęta transgeniczne).

Faktem jest, że klonowanie otwiera w przyszłości nowe horyzonty. Technika stanowi ważny punkt wyjścia do dalszych badań.

 

 

SŁOWNICZEK:

 

BLASTOMERY-komórki powstające w czasie podziałów mitotycznych zygoty. Po kolejnych podziałach powstają 2,4,8,16,32 itd. blastomery.

 

LIGAZY- enzymy tworzące nowe wiązania i wykorzystujące do tego energię z ATP. Zaliczne są do 6 klasy enzymów (syntetazy). W zależności od typu tworzonego wiązania (C-O, C-S, C-N lub C-C) 1. dzieli się na podklasy. Ligazy DNA uczestniczą w łączeniu nici kwasu dezoksyrybonukleinowego, karboksylaza pirogronianowa katalizuje przyłączenie CO do pirogronianu- tworzenie szczawiooctanu.

 

MITOZA-podział pośredni jądra komórkowego prowadzący do powstania 2 jąder                potomnych (siostrzanych), z których każde otrzymuje zestaw chromosomów taki   sam, jak występujący w jądrze komórkowym przed podziałem. Po zakończeniu  mitozy zwykle zachodzi podział cytoplazmy komórki zwany cytokinezą,prowadzący  do powstania 2 komórek potomnych. W procesie mitozy wyróżnia się: profazę,  metafazę, anafazę i telofazę. Mitoza zachodzi w komórkach somatycznych  (budujących ciało organizmów) i prowadzi do wzrostu liczby komórek, a tym samym   wzrostu całego organizmu. U organizmów jednokomórkowych mitoza prowadzi do z zwiększenia liczby osobników. Termin mitoza używany jest również w szerszym znaczeniui obejmuje zarówno podział jądra, jak i cytoplazmy.

 

PLAZMIDY-niewielkie, koliste cząsteczki DNA  występujące w cytoplazmie prokariontów (bakterie i sinice) niezależnie od genoforu oraz w komórkach drożdży poza jądrem komórkowym. Plazmidy ulegają samodzielnej replikacji. Ich obecność w komórce nie jest konieczna, ale może być dla niej istotna ze względu na to, że na terenie plazmidów znajdują się geny o znaczeniu przystosowawczym (np. geny oporności na antybiotyki, produkcję toksyn). Plazmidy wykorzystuje się jako wektory w inżynerii genetycznej.

 

POLIMERAZY-enzymy, które umożliwiają wydłużenie łańcuchów kwasów nukleinowych poprzez dokładnie  nowych nukleotydów. Biorą udział w procesach replikacji i transkrypcji, np. polimeraza DNA, polimeraza RNA (primaza i transkryptaza).

 

TOTIPOTENCJALNOŚĆ-zdolność niektórychkomórek do różnicowania się w komórki różnych tkanek. Komórki takie występują w niewielkich ilościach u wszystkich zwierząt. U parzydełkowców komórki interstycjalne o właściwościach  totipotencjalnych mogąprzekształcać się w gamety lub inne komórki ciała. U roślin takie właściwości posiadają merystemy.


ŹRÓDŁA:

1) Encyklopedia PWN

2) Słownik biologia

3) Polityka- cywilizacja

4) Klonowanie(opracowanie redakcyjne Damian Strączek)